Základem sbírky Muzea loutkářských kultur v Chrudimi se stala soukromá sbírka prof. PhDr. Jana Malíka (1904–1980), neúnavného organizátora loutkářského života, praktika i teoretika, historika, pedagoga a sběratele. Sbírka Jana Malíka má své základy již ve sbírce Jindřicha Veselého, významného propagátora loutkového divadla za 1. republiky, kterou Jan Malík nadále rozšiřoval. Část sbírky získalo nově zřízené muzeum od Jana Malíka darem, část odprodejem. Jan Malík také pomohl zorganizovat, aby jednotlivá národní centra mezinárodní loutkářské organizace UNIMA darovala muzeu loutky ze svých zemí (z Belgie, Bulharska, Finska, Francie, Itálie, Maďarska, Německa, Polska, Rakouska, Rumunska, SSSR – Ruska, Švédska, Velké Británie.) Za dobu existence muzea se pak sbírka značně rozrostla a je stále doplňována. Dnes vlastní muzeum více než 50 000 sbírkových předmětů. Do sbírky kromě loutek patří také scénické návrhy a makety, kulisy, výtvarná díla s loutkářskou tematikou, plakáty a programy, fotografie, zvukové záznamy a videozáznamy, tiskoviny, rukopisy a další archiválie.
Muzeum dokumentuje nejen vývoj českého loutkářství ale také různé podoby loutkového divadla ve světě, které prezentuje výstavní i publikační činností. Sbírka MLK je rozdělena na několik podsbírek, nejvýznamnější je ta, jež je věnovaná samotným loutkám. Sbírka loutek čítá přes 10 000 kusů pocházejících z různých koutů světa. K nejstarším loutkám patří marionety tradičních lidových loutkářů z 19. století. Podle archivních pramenů bylo již na konci 18. století v Čechách a na Moravě na 85 marionetářů, ke kterým již patřili zástupci později významných loutkářských rodů, jako byli Kopečtí, Maiznerové, Kočkové, Dubští. Každý loutkář vlastnil soubor loutek nejméně kolem 15 kusů a některé z nich se nachází ve svírce MLK. Ze zahraniční části sbírky můžeme jmenovat soubor loutek vietnamského vodního loutkového divadla, kolekci stínových loutek z Asie či dokonce z Francie, kde se stínové divadlo rozvinulo do svébytné podoby a v období na přelomu 19. a 20. století získalo nebývalou popularitu a v neposlední řadě i marionetu Tanečnice z pařížského divadla Nabots, jedinou loutku spojovanou s průkopníkem moderního malířství Edgarem Degasem.
Do sbírky patří i nemalé množství loutek pro rodinná loutková divadla. Tento fenomén přišel na počátku 20. století, kdy se rodinná loutková divadla těšila veliké oblibě. Byla vyráběna sériově i podomácku. Zároveň se v loutkách první poloviny 20. století odrážejí nové tendence moderních uměleckých směrů, jako byl kubismus a impresionismu, a prosazuje se vysoká míra stylizace. V tomto období byl vytvořen Spejbl a Hurvínek, začal tvořit Jiří Trnka (známý scénárista a režisér animovaných loutkových filmů) a mnoho dalších významných osobností. Významného rozšíření se v posledních letech dočkala i kolekce filmových loutek dokumentující mistrovství českých filmařů a animátorů od 2. poloviny 20. století do současnosti.
Své místo mají také loutky z amatérských a profesionálních loutkových scén působících na našem území po druhé světové válce a s nimi spojená jména jako např. František Vítek, Pavel Kalfus, Petr Matásek, Alois Tománek apod.
Kromě výše zmíněné podsbírky loutek se v MLK nachází podsbírka Scénografie, ta obsahuje velké množství dekorací a rekvizit pro rodinná loutková divadla, návrhů scén a především malovaných opon kočovných lidových loutkářů z 19. století. Podsbírka Výtvarná díla obsahuje velké množství výtvarných návrhů loutek, scén, originály i reprodukce s loutkářskou tématikou, plakáty a trojrozměrné artefakty. Ve sbírce je několik ceněných originálů od významné české malířky Toyen, Jiřího Trnky, Lotte Reiniger, Jiřího Krohy, Oty Bubeníčka a dalších.
V MLK se rovněž nachází Archiv, který obsahuje velké množství materiálu především české provenience. Velkou část tvoří programy, pozvánky a textové plakáty k inscenacím, loutkářským přehlídkám a festivalům. V menším množství, přesto významném, jsou zde uchovávány rukopisy her (jeden z nejstarších rukopisných záznamů hry Truchlohra o hraběnce Genovefě z Brabantu z roku 1834), korespondence loutkářů, jejich osobní doklady jako např. cestovní knížky a doklady o živnosti. Podsbírka Fotografie je největší podsbírkou Muzea loutkářských kultur, čítá přes 17 000 sbírkových předmětů. Sbírkové předměty mapují pomocí fotografií fenomén loutkářství od počátku 20. století až po současnost. Konkrétně můžeme v podsbírce najít fotografie a diapozitivy z představení, festivalů, výstav, fotografie významných osobností z loutkářského světa, loutek, loutkových divadel a jejich inscenací. Mimo fotografie obsahuje tato podsbírka menší množství filmů a videozáznamů.
Ve sbírce MLK můžeme také najít podsbírku Zvukových záznamů s gramodeskami, magnetofonovými páskami a kazetami, kompaktními disky, které obsahují pohádky, hudbu a písně vztahující se k loutkovému divadlu, různé zvukové efekty, záznamy inscenací a rozhovory. Významnou součástí muzejní sbírky je rovněž Sbírková knihovna čítající přes 18 tisíc svazků a obsahující zvláště vzácné a z loutkářského hlediska významné publikace.